腺病毒包装原理介绍
腺病毒是一种没有包膜的直径为79-90nm的颗粒,由252个 壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7-9nm。衣壳里是线状双链DNA分子,两端各有长约100bp的反向重复序列。人体腺病毒 已知有33种,分别命名为ad1-ad33,研究详细得是ad2.
腺病毒是一种无包膜的球型结构的病毒,遗传物质为线型 双股DNA形式。腺病毒的特点:(1)gan染范围广对人致病性低;(2)对增殖和非增殖细胞均具有gan染性;(3)能有效进行增殖;( 4)病毒滴度高;(5)不整合到染色体中,无插入致突变性;(6)外源基因装载容量大。由于腺病毒的这些特点使其广泛地应用于体 外基因转导、体内接种yi苗、和基因zhi疗等各个领域。
实验方法
1.获得目的基因序列;
2.构建病毒表达载体质粒;
3.表达载体质粒和包装质粒重组;
4.gan染HEK293,包装出病毒;
5.病毒扩增、浓缩;
6.滴度测定。
免yi共沉淀(Co-IP检测)是以抗ti和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的方法。当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质与蛋白质间的相互作用也被保留下来。用预先固化在beads上的蛋白质A的抗ti免yi沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来,再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行检测,进而证明两者间的相互作用。
注意事项
1. 为了避免蛋白质变性,不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。
3. 为了避免蛋白质的氧化,将 0.1~1 mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或 β-巯)加入到缓冲溶液中。
4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏,将 1~10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。
5. 为了避免微生物生长,使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候,基因检测多少钱,均必须时刻对它的稳定性注意维护,pcr,使它的活性得到保护,需要牢记如下一些通用的注意事项。
6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7. 蛋白浓度不要太稀。
8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适,pcr实验室,防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同,使蛋白质的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶,避免蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解,避免 DNA 对蛋白的污染。
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